الایزا
پايه اساسي آزمون الايزا براساس واكنش آنتي‌بادي با آنتي‌ژن مي‌باشد. در آزمون‌هاي الايزا يك آنتي‌بادي اختصاصي با يك آنتي‌ژن مشخص واكنش داده و سپس با استفاده از يك آنتي‌بادي اتصال يافته با يك آنزيم بعنوان سيستم نشانگر، آزمون ادامه يافته و درنهايت با افزودن سوبستراي آنزيم و تبديل سوبسترا به محصول كه يك مادة رنگي مي‌باشد آزمون الايزا به پايان مي‌رسد طول موج رنگ بدست آمده كه نشانگر حضور يك آنتي‌بادي (و يا آنتي‌ژن) و نيز غلظت آن مي‌باشد توسط يك دستگاه اسپكتروفتومتر قرائت شده و ثبت مي‌گردد.
بعنوان مثال در يكي از رايج‌ترين روشهاي الايزا ( روش غير مستقيم) كه براي شناسايي حضور و يا عدم حضور آنتي‌بادي برعليه يك آنتي‌ژن موردنظر بكار مي‌رود ابتدا يك آنتي‌ژن برروي سطح جامد پوشش داده مي‌شود سپس نمونة مجهول كه حضور و يا عدم حضور آنتي‌بادي برعليه اين آنتي‌ژن درون آن مورد بررسي قرار مي‌گيرد بر روي اين سطح جامد پوشش داده شده با آنتي‌ژن, افزوده مي‌شود.
پس از آن آنتي‌بادي ثانويه يا درحقيقت آنتي‌بادي برعليه اين آنتي‌بادي اوليه كه متصل به آنزيم نيز مي‌باشد افزوده مي‌شود و در نهايت سوبستراي آنزيم در اختيار آنزيم قرار داده مي‌شود و پس از گذشت مدت زمان لازم واكنش آنزيمي خاتمه داده شده و رنگ بدست آمده توسط دستگاه اسپكتروفتومتر قرائت مي‌شود.
3مراحل يك آزمون الايزا
مراحل انجام يك آزمون الايزا به‌صورت زير مي‌باشد:
1) جذب يك آنتي‌ژن يا آنتي‌بادي به سطوح جامد پلاستيكي كه اصطلاحا پوشش‌دهي ناميده مي‌شود.
2) افزودن نمونه‌هاي مورد آزمايش
3) انكوباسيون واكنشگرها براي دراختياز قراردادن مدت زمان كافي براي انجام واكنش
4) جدا نمودن واكنشگرهاي متصل شده و واكنش داده از واكنشگرهاي آزاد و متصل نشده با استفاده از عمل شستشو
5) افزودن عوامل متصل شده با آنزيم
6) انكوباسيون واكنشگرها براي دراختيار قراردادن مدت زمان كافي براي انجام واكنش
7) جدا نمودن واكنشگرهاي متصل شده و واكنش داده از واكنشگرهاي آزاد و متصل نشده با استفاده عمل شستشو
8) افزودن سوبستراي آنزيم جهت تشخيص واكنش دهنده‌ها
9) انكوباسيون واكنشگرها براي دراختيار قراردادن مدت زمان كافي براي انجام واكنش
10) خاتمه دادن واكنش آنزيمي توسط متوقف كننده‌ها و قرائت دانسيتة نوري بدست آمده توسط دستگاه اسپكتروفتومتر
شرح مراحل فوق در ادامه آمده است:
3-2-2 فاز جامد
امروزه بيشتر از پليت‌هاي 96 خانه‌اي بعنوان فاز جامد استفاده مي‌شود. انواع انعطاف‌پذير و جداشدني از پلي‌وينيل كرايد و انواع سخت و محكم از پلي‌استيرن ساخته مي‌شوند. هم اكنون شركت‌هاي معتبر و متعددي به‌ساخت انواع مختلف پليت‌هاي الايزا مشغول هستند دربعضي از انواع اين پليت‌ها، كف چاهك‌ها صاف و تخت بوده و بعضي ديگر مقعر مي‌باشند.
بعضي از پليت‌ها داراي خاصيت چسبندگي بالا بوده و بعضي داراي چسبندگي متوسط مي‌باشند. امروزه آزمايشهاي متعددي با موفقيت با هر كدام از اين نوع پليت‌ها انجام مي‌شود و نمي‌توان گفت كه قطعا كدام نوع پليت برتري بر ديگر انواع پليت‌ها دارد. مي‌توان با انجام دو آزمايش الايزاي كاملا يكسان كه تنها در نوع پليت متفاوتند و بررسي نتايج تشخيص داد كه براي كدام نوع از آنتي‌ژن، كدام پليت بهتر است. بطور كلي پليت‌هايي كه انتهاي چاهك‌هاي آنها تخت مي‌باشد توصيه مي‌شود.
3-2-3 پوشش‌دهي
اين مرحله كه يكي از مهمترين مراحل آزمون الايزا مي‌باشد عبارتست از اتصال پروتئين آنتي‌ژن يا آنتي‌بادي بر روي پليت ,درون چاهك هاي يك پليت 96 خانه‌اي, كه عمدتا براساس واكنش هاي آبگريز مابين ماتريكس پلاستيكي و پروتئين مي‌باشد. بنابراين هر پروتئين يك ثابت اتصال متفاوتي با پليت‌ها دارد. اين واكنش بستگي به بار خالص پروتئين ندارد.
بنابراين افزودن هيدروفوبيسيتة واكنش پروتئين – پليت موجب بروز اين نواحي هيدروفوب در پروتئين‌ها شده و واكنش مابين پليت و پروتئين را مستحكم تر مي نمايد، اين دناتوره نمودن جزيي پروتئين‌ها توسط قراردادن پروتئين در معرض دترژنت‌هاي ملايم و مواد داراي pH پائين حاصل مي‌شود كه بعد از اين مجاورت مي‌توان با استفاده از يك روش دياليز مناسب، بافر پوشش‌دهي را با اين مواد دناتوره كننده تعويض نمود.
عمل پوشش‌دهي به عوامل زير بستگي دارد.
الف) مدت زمان پوشش‌دهي
ب) دما
ج) غلظت پروتئين‌هايي كه بايد پوشش داده شوند.
د) نسبت سطح چاهك‌ها به حجم محلول پوشش دهي
هـ) ضريب انتشار مولكولهاي پروتئيني درون محلول پوشش‌دهي درون چاهك‌ها
عوامل فوق يكپارچه بوده و جداي از يكديگر نيستند. يكي از مهمترين موارد بدست آوردن غلظت مناسب از پروتئين براي اتصال مناسب به پليت مي‌باشد كه از طريق تيتراسيون پروتئين بدست مي‌آيد.
محدودة 1 تا 10 μg/ml در حجم 50μl يك راهنمايي خوبي براي بدست آوردن غلظت مناسب اغلب پروتئين‌ها جهت اتصال خوب به پليت مي‌باشد البته اين محدوده وابستگي به خلوص نسبي پروتئين موردنظر جهت پوشش‌دهي دارد بنابراين غلظت يك پروتئين جهت پوشش‌دهي وابسته به فعاليت آن پروتئين مي‌باشد مشخص است كه يك محلول پروتئيني كه داراي مقدار كمي از پروتئين موردنظر باشد مقدار اتصال آن پروتئين به پليت برطبق نسبت حضور آن پروتئين در محلول كم مي‌باشد و ناخالصي‌هاي موجود در محلول پروتئيني سطوحي را كه بايد پروتئين موردنظر ما در اختيار داشته باشد اشغال مي‌نمايند كه در نهايت منجر به يك اندازه‌گيري ضعيف مي‌شود.
با استفاده از چند تست الايزا كه در آنها غلظت پروتئين موردنظر براي پوشش‌دهي متفاوت است مي‌توان به يك غلظت مناسب از پروتئين جهت پوشش دادن دست يافت. توجه به اين مطلب مهم است كه دانسيتة اتصال پروتئين به پليت درنتيجة نهايي بسيار مهم است. اتصال با دانسيتة بالا حتي ممكن اسب برخلاف انتظار ما به نتايج ضعيف منجر شود چرا كه اين دانسيتة بالا مي‌تواند از لحاظ قضايي اجازة نزديك شدن پروتئين دوم (آنتي‌ژن يا آنتي‌بادي) را به پروتئين پوشش داده شده ندهد. درحقيقت مولكولهاي پروتئين پوشش داده شده آنقدر باشدت و استحكام بالايي (و بينابين يكديگر) به سطح چاهك متصل شده‌اند كه حتي جايگاه‌هاي اتصالشان در دسترس اتصال به پروتئين دوم (فرضا آنتي‌بادي) نمي‌باشد.
غلظت‌هاي بالاي پروتئيني كه بايد پوشش داده شود نيز منجر به‌همين مسئله مي‌شود. رابطه غلظت يك آنتي‌ژن يا آنتي‌بادي با چگالي نوري (OD) بدست آمده در مرحلة نهايي تست الايزا يك رابطة خطي صرف نمي‌باشد و براي هر پروتئيني بسته به فرم فضايي آن پروتئين و نيز در هر محدوده‌اي از غلظت‌هاي مختلف آن پروتئين متفاوت مي‌باشد.
ميزان هيدروفوبيسيتة واكنش پروتئين – پليت وابسته به دما نيز مي‌باشد افزايش دما موجب افزايش اين هيدروفوبيسته مي‌شود و دانستيم كه اين افزايش منجر به اتصال مستحكم تر پروتئين به پليت مي شود يكي از رايج‌ترين روشهاي پوشش‌دهي از لحاظ دما، در مجاورت قراردادن پليت با پروتئين در دماي 37°c مي باشد كه در اين دما بين 1 تا 3 ساعت زمان مناسبي براي اغلب پروتئين ها مي‌باشد در مرتبة بعد مي‌توان روش پوشش‌دهي در طول شب در 4°c و يا تركيبي از ايندو را بكار گرفت.
بسته به ماهيت پروتئين‌ها، گاهي اوقات پوشش‌دهي در دماي آزمايشگاه با مدت زمان طولاني‌تر موردنظر قرار مي‌گيرد.
البته مشخص است كه افزايش دما در مدت زمان طولاني ممكن است باعث تغييراتي در ساختار پروتئين موردنظر جهت اتصال به پليت شود. تكان دادن يكنواخت، آرام و منظم پليت نيز مي‌تواند با افزايش ميزان برخورد و درنتيجه اتصال پروتئين به پليت، زمان موردنظر براي پوشش‌دهي را كاهش دهد.
3-2-3-1 بافر پوشش‌دهي
بيشترين بافرهايي كه هم‌اكنون مورد استفاده قرار مي‌گيرند عبارتند از :
- بافر كربنات 6/9 = pH با كربنات 50 ميلی مولار،
- Tris – Hcl بيست ميلی مولار با pH = 8/5 و يا
- PBS 10 ميلی مولار با pH = 7/2
اغلب روشهاي الايزا از يكي از اين سه نوع بافر استفاده مي‌نمايند.
بافرهايي غير از موارد فوق هنگامي مورد استفاده قرار مي‌گيرند كه مشكلي در پوشش‌دهي با بافرهاي فوق بوجود آمده باشد. از لحاظ تئوري بهترين بافري كه مورد استفاده قرار مي گيرد بافري است كه داراي pH برابر با 1 تا 2 واحد بالاتر از (PI) پروتئين اتصالي باشد. اما درعمل اندازه‌گيري اين مطلب آسان نمي‌باشد چراكه پروتئين اتصالي (فرضا آنتي‌ژن) حاوي مخلوطي از پپتيدهاي متفاوت مي‌باشد. با انجام چند آزمايش الايزا كه pHهاي متفاوت و قدرت يوني متفاوتي در بافر پوشش‌دهي داشته باشد مي‌توانيم اتصال بهتر و مناسب‌تر پروتئين به پليت را بدست آوريم.
پروتئين هاي با خاصيت اسيدي، احتياج به يك pH پائين تر جهت خنثي نمودن نيروي دافعه مابين پروتئين و پليت دارند و در آزمايشي جهت پوشش دادن پروتئين هاي ويروس Herpes simplex كه خاصيت اسيدي دارند بهترين pH در محدودة 5/2 تا 6/4 بدست آمده است.
در روش هاي رايج امروزي پوشش دادن با بافر PBS يا كربنات اغلب موفقيت‌آميز است.
گاهي اوقات بعضي از آنتي‌ژن‌ها مشكلاتي را در پوشش‌دهي بوجود مي‌آورند اين آنتي‌ژن‌ها شامل پلي‌ساكاريدها ليپوپلي‌ساكاريدها و گليكوليپيدها هستند كه پوشش‌دهي مستقيم را منجر به نتايج ضعيف و نامناسب مي‌نمايند در اينگونه موارد يك پوشش‌دهي ابتدايي موردنياز است كه با يك آنتي‌سرم اختصاصي انجام مي‌شود كه يك حالت ساندويچي را بوجود مي‌آورد كه در ادامة همين فصل توضيح داده خواهد شد.
بنابراين مخلوط تخليص نشده آنتي‌ژن‌ها مناسب براي پوشش‌دهي مستقيم نمي‌باشد و درصورت نياز از الايزاي ساندويچي استفاده مي‌شود.
بدليل ماهيت غير كووالانسي اتصالي پروتئين به پليت، جداشدن يك پروتئين از پليت نيز ممكن است رخ دهد اما اگر شرايط پايدار و استاندارد باشد اين مطلب تأثير مهمي در يك آزمون الايزا نخواهد گذاشت.