روشهای آزمایشگاهی شناسایی بیماری آبله پرندگان
معرفی :
آبله ، نوعی بیماری ویروسی معمول در طیور صنعتی ( مرغ و بوقلمونها ) میباشد که در سایر پرندگان وحشی نیز مشاهده میشود . درگیری طبیعی با آبله تقریبا در 9000 گونه و 232 رده از پرندگان ، گزارش شده است . آبله ماکیان از نظر اقتصادی واجد اهمیت ویژه ایی میباشد زیرا سبب قطع تولید تخم مرغ و بروز تلفات در گله طیور پرورشی میشود . در این مقاله ، به روشهای مختلف و متفاوت تشخیص این بیماری خواهیم پرداخت .
1 . میکروسکوپی :
اجسام اولیه یا همان اجسام بورل را میتوان از طریق گستره های تهیه شده از ضایعات که با روشهای رنگ آمیزی Wright یا Gimenz رنگ آمیزی شده اند ، شناسایی کرده و مشاهده نمود . مقاطع بافتی بدست آمده از ضایعات جلدی یا دیفتریتیک را نیز میتوان با استفاده از روشهای مرسوم و یا با استفاده از محلولی که توانایی تثبیت و دهیدراته نمودن همزمان بافت را دارند ، از نظر گنجیدگیهای سیتوپلاسمیک بررسی نمود . در واقع ، تکنیکهای بافت شناسی شیمیایی و پاتولوژیک مختلفی توسط تامسون و هانت توصیف شده است . ضایعات جلدی مشخص و همچنین ضایعات دیفتریتیک آبله پرندگان را بایستی به وسیله هیستوپاتولوژی یا جداسازی ویروس ، تصدیق نمود .
با استفاده از میکروسکوپ الکترونی نیز میتوان ذرات ویروس موجود در ضایعه و همچنین اگزودا را مشخص نمود . برای اینکار بایستی برشهای فوق نازکی از بافت مربوطه تهیه نمود و یا از رنگ آمیز منفی استفاده نمود . در بررسیهای صورت گرفته توسط میکروسکوپ الکترونی ، میتوان نوع A گنجیدگیها را به همراه ویرون های موجود در اطراف آن را مشاهده نمود .
2 . جداسازی و شناسایی ویروس :
2 . الف . وارد نمودن ویروس به پرنده :
ویروس آبله پرندگان را میتوان به روشهای مختلفی به پرندگان مستعد منتقل نمود . با استفاده از یک سوسپانسیون حاوی مواد ضایعات این بیماری و از طریق تاج آسیب دیده ، فولیکول پر یا روش Wing – Web میتوان بیماری را به پرندگان مستعد منتقل نمود . FPV میتواند به سرعت و ظرف مدت پنج تا هفت روز ، از جوجه ایی به جوجه دیگر منتقل شود . توجه داشته باشید که این انتقال ، همراه با گسترش ضایعات جلدی مشخص میباشد . در مواردی که ضایعات بیماری نامشخص میباشند ، استفاده از میکروسکوپ الکترونی پیشنهاد میشود .
2 . ب . وارد نمودن به جنین پرندگان :
سوسپانسیونی متشکل از ضایعات پوستی یا دیفتریتیک بدست آمده از نمونه های مشکوک ، در 9 تا 12 روزگی به جنین جوجه های بدست آمده از گله های SPF تزریق میشود . 5 تا 7 روز پس از تلقیح ، CAM را به منظور بررسی ضایعات پوک مورد ارزیابی قرار میدهند . در برخی موارد ، نمونه های جدا شده از رشد در CAM جوجه باز می مانند .
2 . ج . کشت سلولی :
بطور معمول ، کشت سلولی ، روش اصلی بکار رفته به منظور جداسازی ویروس آبله پرندگان نمیباشد . از آنجائیکه برخی از رنگ آمیزیها ، CPE را در تلقیح اولیه تولید نمیکنند نیازمند عادت دادن ویروس به سیستم فوق هستیم . به نظر میرسد که کشت سلولی به منظور مشخص نمودن ساختار ژنیک و آنتی ژنیک ویروس در مقایسه با استفاده از CAM ، مناسبتر میباشد .
3 . سرولوژی و تستهای حفاظتی :
ایمنی فعال بدست آمده بر علیه ویروسهای آبله پرندگان ، بدنبال بهبودی از بیماری یا پس از واکسیناسیون بدست می آیند . هر دو نوع ایمنی همورال و همچنین وابسته به سلولی ، پس از واکسیناسیون و یا رخداد طبیعی بیماری در فراهم نمودن حفاظت برای پرندگان نقشی را ایفا میکنند . اما این نکته را به خاطر داشته باشید که ایمنی وابسته به سلول سریعتر از پاسخ آنتی بادی ناشی از ایمنی همورال گسترش می یابد .
پاسخ ایمنی برعلیه ویروس آبله پرندگان را میتوان با تستهای سرولوژیک چون الایزا ، خنثی سازی ویروسی و یا تستهای حفاظتی معین نمود . تستهای حفاظتی را عموما در جهت معین نمودن ایمنی زایی واکسنهای آبله ماکیان و کبوترها ، بکار می برند . به همین منظور ، و در جهت سنجش میزان تاثیرات واکسنهای ساخته شده ، حداقل 20 جوجه SPF را با واکسن ساخته شده واکسینه میکنند .
از سوی دیگر ، 20 جوجه SPF واکسینه نشده دیگر را از همان منبع و سن انتخاب نموده و بعنوان شاهد در نظر می گیرند . سپس ، سه هفته پس از واکسیناسیون ، پرندگان واکسینه شده و واکسینه نشده را با یک سویه متفاوت FPV که توانایی ایجاد نشانه های کلینیکی آبله در پرندگان را داشته باشد ، چالش میدهند .
ویروس فوق را بایستی از طریق فولیکول پر پاها ، تاج برش داده شده و یا روش Wing – Web در خلاف محل استفاده شده برای واکسیناسیون ، وارد بدن پرنده نمود . سپس بایستی اثرات ایجاد شده را در پرندگان ، بررسی نمود . در صورتیکه حداقل 90 درصد از شاهدها ضایعات آبله ماکیان را نشان دهند و از سوی دیگر ، حداقل 90 درصد از پرندگان واکسینه شده این اثرات را نشان ندهند ، ایمن سازی رضایت بخش خواهد بود .
استفاده از آزمایشات حفاظتی تداخلی به منظور بررسی ارتباط آنتی ژنیک ویروس آبله پرندگان عموما عملی نیست . اما ممکن است به منظور مشخص نمودن خصوصیات بیولوژیک این ویروس ، استفاده از آن الزامی شود .
4 . انتشار ایمنی :
روش فوق به منظور شتاسایی ویروسهای آبله کبوتر و ماکیان و همچنین در جهت تفاوت گذاردن میان پاسخ آنتی بادی ناشی از آبله ماکیان و سایر بیماریهای ویروسی پرندگان ، بکار میرود . برغم سادگی و انجام راحت آزمایش فوق ، حساسیت آن پائین بوده و بدلیل وجود آنتی ژنهای تداخلی ، تشخیص افتراقی مشکل میباشد .
ازآنجائیکه شناسایی کاهش آنتی بادیها تنها برای مدت کوتاهی پس از بیماری امکانپذیر میباشد ، سرم مورد آزمایش را بایستی در زمان مناسبی جمع آوری نمود . مدت زمان فوق ، 15 تا 20 روز پس از ظهور بیماری میباشد .
5 . هماگلوتینین ضعیف :
تست هماگلوتینین ضعیف ، آنتی بادیهای موجود در سرم خونی جوجه های آلوده شده با FPV را سریعتر از آزمایش انتشار ایمنی مشخص میکند . برغم آنکه آزمایش فوق از حساسیت بالایی برخوردار میباشد ، استفاده از آن بدلیل نیاز به گلبولهای قرمز اسب یا گوسفند که برای حساس نمودن آنتی ژنهای قابل حل ویروس آبله استفاده میشوند ، محدود میباشد . علاوه بر آن ، ایجاد تفاوت میان ویروسها ، بدلیل فعالیت تداخلی آنتی ژنها امکانپذیر نیست .
6 . خنثی سازی :
خنثی سازی ویروس در کشت سلولی یا جنین جوجه ممکن است صورت پذیرد . بهرحال ، روش فوق به صورت یک آزمایش تشخیصی روزمره قابل استفاده نخواهد بود .
7 . آنتی بادی فلورسنت ، ایمنوپروکسیداز و الایزا :
آزمایشات ایمنوپراکسیداز یا ایمنوفلورسنس مستقیم یا غیرمستقیم ، با وجود انجام رنگ آمیزیهای خاص ، گنجیدگیهای داخل سیتوپلاسمی در سلولهای درگیر با ویروس را مشخص نخواهند نمود .
از سوی دیگر ، الایزا ، آزمایش انتخابی به منظور تعیین پاسخ آنتی بادی همورال میباشد . پاسخ آنتی بادی ، هفت تا ده روز پس از بیماری ، قابل تشخیص خواهد بود .
8 . ImmunoBlotting :
با استفاده از روش فوق قادر خواهیم بود که پروتئینهای ایمنوژنیک واکسن را با سویه های مزرعه ایی و همچنین ویروس عادی آبله پرندگان ، مقایسه کنیم . گرچه که آنتی ژنهای معمول ، تشخیص داده شده اند ، با توجه به حضور پروتئینهای خاص و همچنین ، حرکات متفاومت الکتروفورز میتوان تفاوتهایی را میان سویه های مختلف قائل شد .
توجه داشته باشید که اخیرا ، دو نوع آنتی بادی منوکلونال به منظور شناسایی FPV سویه های واکسن و مزرعه ایی مورد استفاده قرار گرفته اند .
9 . روشهای ملکولی :
تکنیکهای ملکولی که در جهت تشخیص بیماری و همچنین ویروس آبله استفاده شده اند را در مقالات دیگر بررسی خواهیم نمود .
10 . استفاده از قطعات ژنومیک بعنوان وسیله بررسی :
قطعات ژنومیک خاص یا الیگونوکلوئوتیدهای طراحی شده از روی قطعات منتشر شده FPV ، بعنوان وسیله ایی درجهت تشخیص DNA خاص FPV در نمونه های آزمایشگاهی مورد استفاده قرار میگیرند . DNA خام جداشده از پوست یا ضایعات دیفتریتیک به سطوح جامدی چون غشای نیتروسلولز منتقل شده و سپس با یک قطعه کلون شده یا الیگونوکلوئوتیدها ( بطور معمول با 12p dcTP ) ، هیبرید میشوند .
رویه فوق بسیار حساس و اختصاصی بوده و استفاده از آن در عفونتهای چندگانه توصیه شده است . بعنوان مثال ، استفاده از قطعات ژنومیک خاص ویروس آبله ماکیان به همراه بیماری لارنگوتراکئیت ، گزارش شده است .
11 . فعالیت زنجیره پلیمراز :
قطعات ژنومیک DNA ویروس آبله ماکیان با اندازه های مختلف را میتوان با استفاده از پرایمرهای خاص و روش PCR ، تقویت نمود . تکنیک فوق زمانی موثر و مفید واقع خواهد شد که میزان ویروس موجود در یک نمونه به شدت کم باشد . در نمونه های مخلوط ، قطعاتی با اندازه های مختلف را میتوان با استفاده از پرایمرهای بیماری زای خاصی ، تقویت نمود.
به عنوان مثال ، فرم دیفتریتیک آبله ماکیان و لارنگوتراکئیت ، نشانه های کلینیکی شبیه به هم و همچنین ، ضایعات نایی را تولید میکنند که با استفاده از پرایمرهای خاص ویروسی میتوان این نوع بیماریها را مشخص نمود . استفاده از روش PCR ، بطور رایج به منظور متمایز ساختن ویروسهای آبله واکسن با سویه های مزرعه ایی استفاده میشوند . زیرا سویه های مزرعه ایی شامل پروویروس REV و سویه واکسن ، تنها واجد ترتیب REV LTR میباشد .
منبع :
Disease Of Poultry , 11Th Edition