PCR یا واکنش زنجیره ای پلیمراز چیست؟

پرایمر ها توسط آنزیم DNA  پلیمراز و در حضور   dNTPها از روی DNA الگو ( تک رشته ای است ) همانند سازی میکنند و رشته های جدیدی مکمل رشته های هدف سنتز  میگردد.

مراحل یک سیکل PCR :

1- مرحله Denaturation   : در این مرحله DNA  هدف بر اثر حرارت تک رشته ای میشود.

2- مرحله Annealing  : در این مرحله با کاهش حرارت سیستم ، پرایمر ها در محل مناسب  روی رشته مکمل متصل میشوند

3- مرحله Extension  : در این مرحله که دمای آن برای آنزیم DNA پلیمرازمطلوب میباشد موجب توسعه پرایمر ها شده و همانند سازی DNA هدف انجام میگیرد. محصول PCR  عبارت است از قطعه همانند سازی شده ای که دو طرف این قطعه سکانس پرایمر ها وجود دارند .

 

فاکتور هایی که روی کار آیی PCR  تاثیر دارند:

1- بعد از 25تا 30 سیکل بعلت حرارت آنزیم دناتوره شده و غیر فعال  میشود

2- غلظت زیادرشته های هدف موجب  Reannealingآنها شده و با پرایمر ها رقابت میکنند .

روش PCR  توسط مولیس کارمند شرکت Cetus  ابداع گردید. ابتدا این کار توسط سه  بن  ماری با حرارت های مختلف انجام میگرفت واز آنریم کلنو بعنوان  DNA polymerase   استفاده میشد.  این آنزیم در اثرحرارت   دناتوره میشودو اجبارا"باید دوباره در هر سیکل به واکنش اضافه شود. Saiki از آنزیم    DNA polymerase مقاوم به حرارت که از باکتری ترموس آکواتیکوس خالص  میشود و اصطلاحا" Taq DNA polymerase   گفته میشود  استفاده کرد وامروزه واکنشPCR   بصورت اتوماتیک  انجام  میگیرد.

 

پارامتر های موثر در PCR :

1- زمان و دمای Denaturation  بستگی به تعداد G و C دارد

2- دمای   Annealing پرایمرها  که باید 3-4 درجه کمتر از دمای ذوب پرایمر ها باشد

3- زمانPrimer extension      که به تعداد بازهای بین دوپرایمر بستگی دارد

4- - تعداد سیکلها

5-  Ramp ( زمانی که طول میکشد تا دمای مبدا  دستگاه  به دمای مقصد برسد ) هرچه این زمان کمتر باشد نتیچه کار بهتر است و واکنش زمان کمتری در دمای ناخواسته قرار میگیرد

6- غلظت  dNTP  ها و یون منیزیوم ( اینها مجموعه ای را تشکیل میدهند که موجب فعالیت آنزیم پلیمراز میشوند و غلظت این دو ماده تابعی از یکدیگر میباشند )

7- غلظت Template DNA ( یک دهم تا یک میکروگرم میباشد ) چنانچه DNA هدف بصورت مالتی کپی در ژنوم باشد بهتر است.

8- اضافه کردن تشدید کننده های PCR

10- حذف مها رکننده های آنزیم از محیط

11- بهتر نقطه ذوب پرایمر ها (شبیه هم باشد (  Tm یکسان داشته باشند).

 

طراحی پرایمر :

پرایمر ها ی PCR  بصورت کاملا" اختصاصی ومکمل ناحیه مورد نظر DNA  هدف طراحی میگردند.  پرایمر ها 30-20 بازدارند  و پرایمر های بیش از 30 باز اختصاصیت خوبی ندارند. همچنین پرایمر باید دمای آنیلینگ  بالا داشته باشد. بهتر است تعداد بازهای دوپرایمر مساوی باشند و از پلی پورین یا پلی پیریمیدین  نباشند، همچنین نواحی تکرار شونده نداشته با شند چنانچه بازهای G یا C بصورت تکراری و پشت سرهم باشند پرایمر بصورت لوپ در می آید و عملا" سیستم کار نمیکند. انتهای 3` دو پرایمر  نباید مکمل باشد زیرا پرایمر دایمر تشکیل میشود.

نرم افزارهایی وجود دارد که طراحی پرایمر را انجام میدهند. بعد از طراحی پرایمر بهتر است تو سط نرم افزارهایی مانند Blast آنها  را چک نمود تا مشخص شود که با چه ژنهای دیکر میتوانندAnneal  گردند.

 

در هر سیکل PCR تعداد مولکولهای  DNA دو برابر میشود. رشته های DNA  توسط حرارت (95-93درجه ) از یکدیگر باز میشوند  ( Denaturing ) و سپس دردوره بعدکه حرارت پایین می آید (60-50درجه ) پرایمر ها بصورت اختصاصی به ناحیه هدف متصل میشوند    ( Annealing ).    آنزیم Taq DNA polymerase           در دمای مطلوب    (72درجه )     ودر بافر مخصوص ,   چهار( dATP, dTTP, dCTP, dGTP ) dNTP  را طبق رشته الگو بهم متصل میکند (Extension ) .

لازم به ذکر است که DNA  های کوتاه ( Short target product ) یعنی رشته هایی که بین دوپرایمر محصور هستند  بصورت تصاعد هندسی (exponential )  و DNA  های بلند ( long target product )  یعنی رشته هایی که از یک طرف توسط یک پرایمر محدود هستند و از سمت دیگر نامحدود میباشند بصورت تصاعد حسابی (linearly )  زیاد میشوند .

مواقعی که پرایمر ها کاملا" مکمل DNA هدف( الگو) نباشند :

1- پرایمر هایی که برای  ایجاد موتاسیون در یک ژن طراحی میگردند

2- پرایمرهایی که سمت 5` آنها جایگاه شناسایی آنزیم محدودگر تعبیه میشود تا بتوان  محصول PCR  را توسط آن آنزیم برش داد . این کار برای کلون کردن محصول PCR  انجام میشود.

3- پرایمر هایی که لازم است محصول PCR  آنها دارای پروموتور باشد و برای بیان یک ژن کاربرد دارند

فاصله دو پرایمر باید کمتر از 10 kb  باشد ( کارآیی همانند سازی برای محصول PCR بیش از 3kb کمتر است ) . بهتر است پرایمر ها را بر حسب کاری که لازم داریم طراحی شوند

 

چگونگی رد یابی ( detect ) محصول PCR :

1- هیبرید شدن محصول PCR با الیگو نوکلئوتید نشاندار ( پروب )

3- الکتروفورز روی ژل آگارز یا پلی اکریلامید

 

انواع PCR  ( بمنظور تصحیح محصول ):

1- Hot start PCR  : عبارت است از جدا کردن یک یا چند ترکیب مهم PCR  ( ترجیحا" انزیم پلیمراز) بطوریکه بلا فاصله بعد ار دناتوراسیون DNA هدف به واکنش اضافه میشوند  ( استفاده از , PCR gem  و آنتی بادی آنزیم پلیمراز )

- Hot start  بکمک آنتی بادی : مونوکلونال آنتی بادی ضد آنزیم پلیمراز را به واکنش اضافه میکننددرنتیجه  فعالیت پلیمرازی آنزیم را مهار میکند. هنگامیکه دمای واکنش به 94 درجه میرسد آتی بادی دناتوره میشود و دو باره  پلیمراز فعال میشود.

- Hot start  بکمک Ampliwax : به دیواره لوله های محصوص اینکاربه نوعی واکس آغشته است که بعد از مختصری گرم کردن ذوب شده و روی ئاکنش را میپوشاند .  آنزیم پلیمراز را روی واکس قرار میدهند . در دمای 94 درجه این واکس بخار میشود و آنزیم پلیمراز با واکنش تماس پیدا میکند

2- Touch down PCR :  در این روش دمای آنیلینگ ازدمای بالاتر از Tm  بندرت کاهش میابد وموجب کاهش  محصول کاذب و پرایمر دایمر میشود.

3- Nested PCR  : مواقعی که DNA هدف در نمونه مورد آزمایش کم باشد برای جلوگیری از بالابردن مقدار DNA و مهار واکنش  توسط پرایمر های خارجی قطعه طویلتری همانند سازی میشود و از محصول PCR  اول که بیشتر DNA هدف همانند سازی شده است یک واکنش دیگر  با پرایمر های داخلی انجام میگیرد. در این روش اختصاصیت و حساسیت PCR بالا میرود.

5- Long distance PCR  : با این روش قطعات ببیش از 20 kb همانند سازی میشوند. برای انجام این نوع PCR باید DNA  ژنومی از کیفیت بالایی برخوردار باشدو پرایمر ها  به دقت طراحی شوند. برای اینکاراز klon taq استفاده میشود.این آنزیم نسخه ای از DNA poly  است که قسمت N ترمینال آن حذف شده است و با pfu poly به نسبت 180 به 1 مخلوط میشود و فاقد 5` اگزو نوکلئازی است

کلونینگ با PCR :

1- قرار دادن جایگاه شناسایی آنزیمهای برش دهنده  در طرف 5`  سکانس پرایمر.

مشکلات : این جایگاه ممکن است روی قطعه همانند سازی شده نیز وجود داشته باشد.

گاهی این جایگاه هنگام هضم شدن با آنزیم اشکال ایجاد میکندکه باید تعدادی باز به انتهای 5`  پراپمر   اضافه شود.

استفاده از جایگاه دو آنریم متفاوت در هضم اشکال ایجاد میکند.

2- Blunt end ligation : برای اینکار دو انتهای قطعه همانند سازی شده باید Polish  شود این کار توسط آنزیمهای کلنو و T4 DNA polymerase  ( پرکردن قسمت over hang   ) و یا آنزیم های S1 nuclease   و Mong bean nuclease   انجام میشود

3- - T vector  پلاسمید ناقل را با آنزیم EcoRV ویا هر آنزیم دیگرکه DNA را بصورت Blunt برش میدهد هضم میکنند سپس توسط آنزیم Terminal transferase یا آنزیم Taq poly تعدادی T به انتهاهای 3` رشته های پلاسمید خطی شده اضافه میکنند .( لازم به ذکراست که آنزیم Taq poly دارای خاصیت ترمینال ترانسفرازی است و تعدادی A به انتهای 3` محصول آمپلی فای شده اضافه میکند ) . با انجام واکنش Ligation  پلاسمید و محصول PCR را بهم متصل میکنند.

4- تولید نیمه جایگاه شناسایی یک آنزیم برش دهنده در طرف 5`  پرایمر. قطعات با T4 poly nucleotidkinase  و ATP فسفریله میشوند و سپس بهم متصل میگردند ، بعد توسط یک آنزیم هضم شده و کلونینگ انجام میگیرد .

 

شکل شماره 13- کلون کردن محصول PCR به روش T-A cloning :  پلاسمید با یک آنزیمی که DNA را بصورت blunt  قطع میکند هضم میشود سپس توسط آنزیم ترمینال ترانسفراز یا Taq پلیمراز و dTTP یک باز T به انتهاهای 3`- OH  آن اضافه میگردد. واکنش Ligation از این وکتور با محصول PCR که در انتهاهای 3`-OH  آن باز A قرار دارد انجام میگیرد و پلاسمید در یک باکتری ترانسفرم میشود.

ایجاد تغییر در محصول PCR :

میتوان درسمت  پایه5`` پرایمر یک  پروموتور ویا  جایگاه اتصال ریبوروم ( Ribosom Binding Site )  تعبیه نمود،  همچنین  میتوان یک Non tanslated leader  بین پروموتور و ژن قرار داد تا ناحیه برای شروع سنتز پروتئین مناسب باشد. این کاربرد بنام Expression PCR  گفته میشود

.

باید ها و نباید ها  در PCR

1. هنگام تهیه واکنش نمونه کنترل مثبت را آخر کار تهیه کنید

2. اعمال قبل و بعد از PCR جدا از همدیگر انجام گیرند

3. برای استفاده ازهر ماده از پیپت جدا گانه و اختصاصی استفاده  کنید

4. از پیپت هایی که دارای plug   هستند و یا از پیپت های یکبار مصرف استفاده کنید

5. مواد ذخیره آزمایشگاه را تقسیم کرده و فریز کنید و هرچند وقت صحت آنها راکنترل کنید

6. هنگام استفاده هرلوله را spin کنید تا موادی که به اطراف  درب لوله چسبیده اند رسوب کنند

7. چند ین کنترل منفی حین آزمایش Run کنید

8. برای انحام آزمایشهای تاییدی ازموادفریز شده استفاده کنید

9. هیشه DNA  آمپلی فای شده را خارج از محل آماده کردن نمونه نگهداری کنید

10. هنگام کار با  PCR product  مقداری از آن را جدا گانه  نگهدارید

روش PCR

اطلاعات اولیه

این روش فوق العاده ساده بوده و با استفاده از تغییرات حرارت می‌توان چندین فرآیند را به دنبال همدیگر انجام داد. با این تکنیک می‌توان به عنوان یک روش قدرتمند تشخیص بالینی (Diagnostic) برای وجود موتاسیون‌ها در ژنوم انسانی ، یا برای وارد کردن جهش‌های ویژه به داخل ژن همسانه شده ، استفاده کرد.

PCR بطور دستی و با قرار دادن پر زحمت و انتقال لوله‌های آزمایش بین حمام‌های آب دارای دمای لازم ، بوجود آمد. امروزه دستگاههایی بطور تجارتی تهیه می‌شوند که در آنها جایگاههای لوله‌ای با بلوک فلزی حرارت پذیر تعبیه شده است و قابل برنامه ریزی برای تغییر سریع بین دماهای لازم است. π چرخه PCR ، DNAی مورد نظر را 2π بار تکثیر می‌کند.

تاریخچه

در گذشته معمولا از روش های شیمیایی برای تولید قطعات نوکلئوتیدی استفاده می‌کردند، اما این روش ها پر زحمت بوده و نیاز به مدت زمان طولانی داشتند از سال 1980 به بعد عمدتا از روش PCR در آزمایشگاههای زیست شناسی مولکولی استفاده می‌شود.

مراحل PCR

• مرحله دناتوراسیون DNA: در مرحله اول برای مدت کوتاهی (30S) قطعات DNA را در درجه حرارت 94 درجه سانتیگراد حرارت می‌دهند تا دو زنجیره DNA از هم باز نشود.
• مرحله پرایمر و مرحله اتصال دو قطعه نوکلئوتیدی: این قطعات معمولا از 25 - 18 باز آلی تشکیل می‌شوند و می‌توانند به قطعات مکمل خود که بر روی ژن مورد نظر قرار می‌گیرند، اتصال یابند. قطعه‌ای که در آن PCR به تعداد زیاد ساخته می‌شود. ما بین دو پرایمر ساخته می‌شود. مرحله اتصال پرایمرها کوتاه بوده و حدودا 30S در دمای 65 - 30 درجه سانتیگراد صورت می‌گیرد.
• مرحله پلیمریزاسیون یا مرحله سنتز: در این مرحله با دخالت آنزیم DNA پلیمر از بر روی رشته DNA الگو. سنتز DNA با استفاده از نوکلئوتید تری فسفات‌هایی که در محلول وجود دارند، صورت می‌گیرد و برای سنتز DNA همیشه یک رشته DNA به صورت الگو و یک قطعه پلی نوکلئوتیدی به عنوان پرایمر مورد نیاز است.

ادامه PCR بعد از چرخه اول

بعد از این 3 مرحله ، چرخه اول تمام می‌شود، چرخه‌های بعدی تکرار چرخه اول است. بدین صورت به دنبال چرخه‌های متعدد PCR قطعه DNA مورد نظر بطور تصاعدی افزایش می‌یابد. یعنی از 20 چرخه ، ژن مورد نظر دارای بیش از 250 هزار خواهد بود. بنابراین روش PCR روش کارا در ازدیاد یک قطعه از DNA است.

کاربردهای مهم PCR

• تهیه نسخه‌های متعدد از یک ژن مورد نظر: گاهی برای مطالعات بیولوژی مولکولی لازم است که یک ژن با نسخه‌های نسبتا زیاد در دسترس باشد. بدین منظور می‌توان با استفاده از روش PCR ژن مورد نظر را در مقایسه با بقیه ژن‌ها تکثیر نمود.
• بررسی حضور یا عدم حضور یک ژن: با استفاده از این روش می‌توان تشخیص داد که آیا یک ژن در یک سلول حضور دارد یا نه؟ گاهی نیز از این مطالعات برای بررسی وجود ژنهای مختلف باکتری‌ها یا ویروس‌ها در بدن افراد استفاده می‌کنند.
• تشخیص بیماری‌های قبل از تولد: با استفاده از PCR و بکار گرفتن پرایمرهای مربوط به یک ژن بیمار و پرایمرهای مربوط به ژن سالم آلل آن می‌توان از تولد کودکان دارای بیماری‌های ژنتیکی جلوگیری کرد. برای این کار بعد از لقاح تخمک در آزمایشگاه ، بعد از رسیدن تخمک به حالت 10 سلولی ، یک سلول را جدا کرده و با استفاده از پرایمرها از ژن مورد نظر PCR صورت می‌گیرد، اگر بعد از PCR منحصرا ژن سالم تکثیر پیدا کرد، این مفهوم هموزیگوت بودن سلول‌های جنینی و سالم بودن آنهاست.
• تعیین جنسیت جنین: معمولا چند تخمک با چند اسپرم در آزمایشگاه لقاح می‌یابند و سپس اجازه تکثیر به سلول تخم داده و با رسیدن تخم به مرحله ده سلولی ، یکی از سلول‌ها را جدا کرده و بوسیله پرایمرهای ویژه مربوط به کروموزوم y مورد PCR قرار می‌گیرد. کروموزوم y منحصرا در سلول‌های نر دیده می‌شود. اگر قطعه تولید نشده در PCR بوسیله الکتروفورز و بطور دقیق‌تر توسط ساترن بلوتینگ تشخیص داده شد، جنین از نوع پسر و در غیر این صورت دارای کروموزوم‌های xx خواهد بود.

تشخیص بیماریها

کشت میکروبها که جهت تشخیص بیماریهای عفونی در اکثر آزمایشگاهها بکار می‌رود. زمان‌بر بوده و ثانیا باعث افزایش تعداد میکروب‌های بیماریزا و غیر بیماریزا در شرایط آزمایشگاهی می‌گردد. امروزه در برخی آزمایشگاهها روش PCR جایگزین روش‌های کشت شده است. یعنی قطعه‌ای از ژن مربوط به میکروب بیماریزا مورد شناسایی قرار گرفته و پرایمرهای مربوط تولید می‌شوند، با استفاده از این پرایمرها می‌توان تشخیص داد که آیا ویروس ایدز در داخل بدن وجود دارد یا نه؟ 

مشکل PCR و راه حل آن

اشکال PCR ، آلودگی نمونه‌های مورد بررسی توسط قطعات DNA خارجی است. اگر قبلا در داخل دستگاهی PCR یک نمونه انجام گرفته باشد. و ذره کوچکی از آن در داخل دستگاه باقی بماند. در PCR نمونه بعدی مشکل ایجاد خواهد کرد. برای رفع مشکل امروزه از ظروف یکبار مصرف استفاده می‌شود. کلیه ظروف قبل از استفاده اتوکلاو می‌شوند تا سلول‌ها و مولکولهای موجود در آنها ، حتی‌الامکان غیر فعال می‌شوند.

یکی از روش‌های پیشنهادی انجام PCR داخلی یا Nestied PCR است. از این روش با استفاده از دو پرایمر قطعه‌ای از DNA را تکثیر می‌دهند و سپس قطعه‌ای دیگر در داخل DNA‌های تکثیر شده PCR می‌شود. بدین صورت احتمال آلودگی کاهش می‌یابد

اين تکنيک تمامی مشکلات قبلی در زيست مولکولی که ناشی از عدم دسترسی به مقادير زياد از DNA يکسان بود را برطرف کرد . برای مثال قبلاً برای بدست آوردن نسخه های متعدد از يک ژن خاص می بايست اين
ژن را به داخل حامل مناسب وارد کرده و در يک باکتری تکثير کنند ولی امروزه اين کار را به سادگی و با استفاده از PCR انجام می دهند.
PCR از نظر اصول عملی تشابه زيادی به همانند سازی DNA دارد و در واقع برگرفته از آن است . ياد آوری می شود که DNA پليمراز DNA تک رشته ای را از جهت
5َ 3َ به عنوان الگو مورد استفاده قرار می دهد ورشته مکمل را در جهت 3َ 5َ
می سازد . همچنين DNA پليمراز برای شروع احتياج به يک قطعه اوليه ( شناساگر ) دارد .
برای انجام PCR ، DNA پليمراز ، نوکلئوتيد تری فسفات ها و پرايمر لازم هستند . از آنجائيکه DNA دو رشته ای است ، دو نوع پرايمر در PCR مورد نياز است . اين دو پرايمر دو عمل انجام می دهند ، اول اينکه محل ژنی که بايد تکثير شود را مشخص می نمايند و دوم اينکه اندازه ی قطعات تکثير شونده را تعيين می کنند . عمل اول کاملاَ مشخص است ، در مورد عمل دوم بايد گفت که وقتی اين دو شناساگر به دو ناحيه ی مختلف DNA و به سمت هم قرار می گيرند DNA پليمراز تنها قطعات را در بين اين دو ناحيه همانند سازی می کند و به اين ترتيب طول قطعات ساخته شده تعيين می شود .
برای شروع PCR ، DNA الگو ، پرايمر ها و نوکلئوتيد تری فسفات ها و DNA پليمراز در يک لوله با هم مخلوط می شوند . سپس لوله را گرم می کنند تا دو رشته DNA از هم جدا شوند . سپس لوله را سرد می کنند تا پرايمر ها به نواحی مورد نظر متصل شوند و DNA پليمراز شروع به همانند سازی از روی DNA بنمايد . بعد از مدت زمان لازم برای همانند سازی بار ديگر پرايمر ها به نواحی مکمل خود متصل شوند . چون در مرحله ی قبل رشته DNA در ناحيه مورد نظر مضاعف شده است ، در اين مرحله چهار رشته ی الگو برای همانند سازی وجود دارد و در نتيجه در پايان اين مرحله بوجود مي آيد ، و در مرحله ی بعد 16 نسخه و به همين صورت بطور تصاعدی تعداد نسخه های ژن ها زياد می شود .
در ابتدای طراحی PCR از آنزيم DNA پليمراز E.coli استفاده شد ولی اين آنزيم به حرارت حساس می باشد و بنابراين پس از هر بار حرارت دادن محيط واکنش تا دمای 94 درجه ی سانتی گراد ، افزودن دوباره ی آنزيم تازه به محيط لازم بود . يکی از مهم ترين کشفيات در اين زمينه اين بود که باکتريهای چشمه های آب گرم دارای DNA پليمراز هايی هستند که نسبت به حرارت مقاوم بوده و حتی در دمای بالا فعاليت بهتری دارند . برای مثال باکتری Thermus aquaticus دارای DNA پليمرازی است که در دمای 94 درجه ی سانتی گراد کاملاَ پايدار است و همچنين دمای اپتيمم عمل آن نيز 72 درجه ی سانتی گراد می باشد ، اين DNA پليمراز که بطور خلاصه Taq پليمراز ناميده می شود باعث شد که براحتی PCR به صورت اتوماتيک انجام شود و با افزودن يکبار آنزيم Taq پليمراز ديگر نيازی به اضافه کردن مجدد آن نباشد .
مزيت بسيار مهم ديگر Taq پليمراز افزايش حساسيت و دقت PCR می باشد . در دمای پايين ( 30 درجه سانتی گراد ) ( که برای DNA پليمراز E.coli بکار می رفت ) پرايمر ها ممکن است به جايگاههايی که توالی تا حدودی مشابه دارند نيز متصل شوند ، زيرا در دمای پايين تعداد کمتری پيوند هيدروژنی برای اتصال پرايمر ها نياز است . بنابراين پرايمر ها با اتصال به نواحی نسبتاَ مشابه ، باعث ايجاد اشتباه در انجام مراحل PCR می شوند . ولی وقتی که واکنش در دمای 72 درجه ( دمای اپتيمم فعاليت Taq پليمراز ) انجام شود اتصال پرايمر ها به نواحی غير از ناحِيه ی اصلی کاهش می يابد . به اين صورت پس از پايان PCR رشته های DNA کاملاَ مشابه و خالص بدست خواهد آمد .
برای ديدن قطعات تکثير شده DNA می توان براحتی از الکتروفورز برای ژل آگاروز و رنگاميزی اتيديوم برومايد استفاده کرد .
کاربردهای PCR :
تکنيک PCR کاربردهای نا محدودی در عرصه های مختلف زيست مولکولی دارد ، علت اصلی اين امر اين است که DNA الگوی بکار رفته در PCR را می توان از منابع مختلف تامين کرده و مورد استفاده قرار داد .
بطور کلی PCR به دو منظور اصلی بکار می رود :
1 – تهيه ی نسخه های متعدد از يک ژن
2 – بررسی حضور يا عدم حضور يک ژن خاص در يک قطعه DNA

· تهيه ی نسخه های متعدد از يک ژن :
برای اين کار بجای اينکه هر دو پرايمر مورد نياز برای PCR را به يک ميزان به محيط واکنش اضافه کنند ، يکی از پرايمر ها را به تعداد کمتر پرايمر ديگر را به تعداد بيشتر اضافه می کنند . در هنگام انجام PCR ، در ابتدا هر دو رشته با هم همانند سازی می کنند ولی پس از تمام شدن يکی از پرايمر ها فقط رشته ديگر که هنوز پرايمر آن وجود دارد ساخته می شود و به همين دليل نسخه های بيشتری از اين رشته بوجود می آيد. پس از پايان PCR چند نسخه DNA دو رشته ای از ژن مورد نظر ايجاد خواهد شد که می توان به طور مستقيم در روش سانجر بکار برد .
مثال ديگری از کاربردهای PCR بررسی پيوستگی ژنها و تعيين فاصله ی بين ژنها بر روی کروموزومهای انسان است . در ژنتيک برای تعيين فاصله ی بين ژنها از بررسی تعداد نوترکيبها به نسبت فنوتيپ والدين استفاده می شود . اين روش برای مگس سرکه که زادآوری آن در هر نسل بسيار زياد و دوره ی رشد آن نيز کوتاه است به راحتی قابل انجام است ولی در مورد انسان که زاده های آن در هر نسل بسيار محدود و با فاصله ی زمانی زياد می باشد ، اين بررسی هابه سختی و با محدوديت بسيار انجام می گيرد . ولی امروزه دانشمندان با استفاده از PCR روش جديدی را برای اين کار پيدا کرده اند . برای اين کار از بررسی آللهای موجود در يک اسپرم استفاده می شود . از آنجائيکه اسپرمها هاپلوئيد بوده و در هر اسپرم از هر کروموزوم يک عدد وجود دارد ، با بررسی همزمان دو ژن بر روی يک کروموزوم و تعيين ميزان نوترکيبی بين اين دو ژن می توان فاصله ی ژنتيکی بين دو ژن را تعيين کرد . در واقع از نظر ژنتيکی بررسی 1000 اسپرم با بررسی 1000 فرزند يک خانواده برابر است . با استفاده از اين روش ثابت شده است که ميزان نوترکيبی کروموزومها در مردها با ميزان نوترکيبی در زنها متفاوت است .
بررسی حضور يا عدم حضور يک ژن خاص در مخلوطی از DNA :
به جرات می توان گفت که اين کاربرد دوم PCR مهمترين کاربرد آن و علت اصلی
گسترش روزافزون آن در کليه ی شاخه های علوم زيست مولکولی است . تعدادی از اين کاربردها عبارتند از :
الف ) تشخيص قبل از تولد بيماريهای ژنتيکی :
در اين روش تعدادی از سلولهای جنين را استخراج کرده و با پرايمر اختصاصی برای يک ژن بيماری مجاور مي کنند ، همچنين بطور جداگانه با پرايمر ژن سالم نيز مجاور می کنند و PCR انجام می دهند . پس از پايان PCR تفسير آزمايش چنين خواهد بود : اگر در هردو لوله سنتز DNA انجام شود ، جنين يک ژن سالم و يک ژن بيمار دارد يعنی حامل است ولی بيمار نيست . اگر سنتز DNA فقط در لوله ای که شناساگر مخصوص ژن بيمار وجود دارد انجام شود جنين بيمار است و بايد سقط شود . اگر سنتز DNA فقط در لوله ای که حاوی شناساگر ژن سالم است انجام شود ، جنين کاملاَ سالم است .
امروزه بسياری از بيماريهای ژنتيکی مانند هموفيلی ، کم خونی داسی شکل ، سيستيک فيبروزيز (Cystic Fibrosis ) ، تالاسمی ، سندرم لش – نيهان ، ديستروفی عضلانی دوشن ، فاويسم ، فنيل کتون اوری و غيره را می توان به کمک PCR تشخيص داد.
ب ) تعيين جنسيت جنين :
برای اين کار تعدادی از تخمک های زن را خارج مي کنند و در شرايط آزمايشگاهی با اسپرمها آميزش می دهند و هر يک از سلولهای تخم تشکيل شده را بطور جداگانه کشت می دهند تا اينکه جنين به مرحله ی 10 سلولی برسد . سپس از هر جنين يک سلول را جدا کرده و همراه با پرايمرهای اختصاصی برای کروموزوم y در لوله PCR وارد می کنند.سپس PCR و در پايان الکتروفورز انجام می شود . در هر يک از لوله ها که جنين نر ( يعنی کروموزوم y ) وجود داشته باشد ، سنتز DNA صورت می گيرد و در لوله ی ديگر نه . حال جنسيت تمامی جنين ها مشخص می باشد و می توان به اختيار خود پسر يا دختر را انتخاب کرده و جنين مورد نطر را به مادر انتقال داد . امروزه تکنيک فوق علاوه بر تعيين جنسيت برای خانواده هايی که در معرض خطر بيماريهای وابسطه به X ( مانند هموفيلی ) هستند نيز استفاده می شود . به اين صورت که جنين ها ی اوليه را از نظر وجود ژن بيمار با استفاده از پرايمر اختصاصی آن مورد بررسی قرار می دهند و جنين سالم را به مادر منتقل می کنند .
شايد باورنکردنی باشد که تمامی مراحل بالا يعنی استخراج تخمک از مادر ، لقاح ، تکثير ، PCR و انتقال مجدد به مادر در مدت زمان يک روز قابل انجام است .
راه ديگر تعيين جنسيت جنين استفاده از خون مادر است . در طی دوران بارداری مقداری از سلولهای جنين وارد خون مادر می شوند . حال اگر PCR برای قطعه ی DYZl ( در حدود 5000 نسخه از اين قطعه بر روی کروموزوم y قرار دارد ) بر روی خون مادر انجام شود و جواب مثبت باشد چون مادر کروموزوم y ندارد پس اين ژن مربوط به کروموزوم y جنين است و جنس جنين نر تعيين می شود .

بررسی عفونت های باکتريايی و ويروسی :
هم اکنون در بعضی از آزمايشگاهها از PCR برای تشخيص ايدز استفاده می کنند. برای اين کار از خون محيطی نمونه گيری می کنند و از توالی های اختصاصی ويروس HIV نيز به عنوان شناساگر استفاده می کنند ، سنتز DNA نشان دهنده ی عفونت ايدز است.
استفاده ديگر PCR در تشخيص بيماری سل می باشد . مايکوباکتريوم توبرکلوزيس يک باکتری بسيار کند رشد است و رشد معمولی آن در آزمايشگاه حدود 20 روز طول می کشد. در PCR بيماری سل از نمونه ی خلط فرد بيمار به همراه پرايمرهايی که برای توالی خاص مايکوباکتريومهای مکمل می باشند ، مورد استفاده قرار می گيرد . پس از انجام PCR قطعات DNA بدست آمده در مجاورت شناساگرهای اختصاصی برای سوشهای مختلف مايکوباکتريومها قرار می گيرد و به اين صورت گونه و سوش آن تشخيص داده می شود .

تشخيص جهش ها و سرطان ها :
در هر سلول معمولاَ از يک ژن فقط يک نسخه وجود دارد ، و در صورتی که اين ژن دچار جهش شود بررسی اين جهش بسيار مشکل خواهد بود ، زيرا در سلولهای انسان پيدا کردن يک ژن در ميان کل ژنوم انسان ، همانند پيدا کردن سوزن در انبار کاه خواهد بود و پس از پيدا کردن ژن جهش يافته نيز به دليل محدوديت نسخه های اين ژن بررسی کميت و کيفيت جهش در آن مشکل خواد بود .
ولی امروزه PCR کار را بسيار راحت نموده است . کافی است که يک سالم و يک سلول جهش يافته بطور جداگانه برای يک ژن خاص تحت PCR قرار گيرند و محصولات حاصل با هم مقايسه شوند . به اين ترتيب به راحتی می توان محل جهش ، نوع جهش و هر نوع اطلاعات لازم ديگر را به دست آورد .
استفاده ديگر PCR در بررسی مراحل درمانی سرطان می باشد . داروهای مورد استفاده در درمان سرطان داروهای سيتوتوکسيک می باشد که عوارض جانبی بسيار زيادی به همراه دارند. به همين دليل نيز سرطان شناسان مايل اند که از مراحل بهبودی سرطان اطلاع داشته باشند تا به محض از بين رفتن سلول بدخيم درمان را متوقف نمايند ، ولی در صورتی که بهبودی کامل حاصل نشده باشد ، احتمال عود مجدد بيماری وجود خواهد داشت. با استفاده از PCR دقت تعيين سلولهای سرطانی بسيار بالا می رود که اهميت آن ناگفته پيداست و به همين دليل PCR منفی را می توان به معنای بهبودی کامل در نظر گرفت .

تعيين تواليهای کروموزومی انسان در سلولهای هيبريدی ( هتروکاريونها ) :
يکی از تکنيکهای بررسی ژنوم انسان ، تلفيق ( هيبريد کردن ) هسته های سلولهای انسانی با سلولهای حيوانات ديگر مثلاَ موش است . پس از انجام تلفيق دو هسته ، کروموزومهای انسان به تدريج حذف می شوند ، تا اينکه نهايتاَ يک کروموزوم در درون هسته هيبريدی باقی می ماند . حال گاهی به منظور بررسی های بيشتر لازم می شود که اين قسمتهای ژنوم انسان تکثير شوند ، مثلاَ وقتی که يک ژن خاص مورد بررسی قرار می گيرد . برای اين کار ازنوع خاصی از PCR که به Alu-PCR معروف است استفاده می شود.
در اين روش از پرايمرهايی استفاده می شود که مکمل تواليهای بسيار تکراری ژنوم ها می باشد ، اين توالی های 300 جفت بازی که گاهی تا 900000 بار در ژنوم انسان و ديگر پستانداران تکرار می شود را تکرارهای Alu می نامند . اين توالی ها بسيار متغير می باشند ولی در انسان قسمتی از اين توالی ها اختصاصی و ثابت است و به همين دليل به راحتی می توان از آن برای تکثير قطعات DNA که بين دو تکرار توالی Alu قرار دارند استفاده کرد . سپس اين DNA را می توان خارج نمود و از نظر نوع پروتئين مورد سنتز و يا تعيين توالی و غيره مورد بررسی قرار داد . مهمترين استفاده روش فوق تعيين مکان ژنتيکی ژنهای مختلف برروی کروموزومهای انسان است که تا قبل از اين روش تقريباَ
نا ممکن ويا بسيار مشکل بود .
مشکلات PCR :
با تمامی مزيت های فوق PCR مشکلات خاص خود را دارد . مهمترين مشکل PCR آلودگی نمونه های مورد بررسی است . به دليل حساسيت فوق العاده و قدرت تکثير زياد PCR هر قطعه DNA خارجی که وارد محيط PCR شود ، مورد تکثير قرار گرفته و نتايج عجيب و دور از واقعيتی به وجود خواهد آورد . برای مثال در مورد تحقيقی که در تعيين جنسيت با استفاده از خون مادران باردار بيان شد ، در بين جوابها يک مورد مثبت کاذب برای يکی از زنان غير باردار که به عنوان شاهد منفی استفاده شده بود ، وجود داشت . پس از بررسی معلوم شد که تعداد ناچيزی از سلولهای پوست يکی از کارکنان مرد آزمايشگاه وارد لوله ی PCR شده است . گاهی نيز باقيمانده ی قطعات DNA حاصل از تکثير DNA های قبلی باعث آلودگی PCR می شود که در اين مورد شستشوی زياد و دقيق مشکل گشا است .



واکنش زنجيره ی پليمراز نسخه برداری معکوس : RT-PCR
واکنش زنجيره پليمراز نسخه برداری معکوس ( RT-PCR ) تعديلی از واکنش زنجيره پليمراز PCR ) ) برای تقويت اطلاعات محتوی اسيد ريبو نوکلئيک (RNA ) توسط تبديل آن به DNA و سپس تقويت آن می باشد . رشته ی RNA در ابتدا به صورت معکوس به مکمل DNA خود يا DNA مکمل نسخه برداری می شود و با تقويت DNA حاصله با استفاده از واکنش زنجيره پليمراز دنبال می گردد . اين می تواند يک فرآيند 1 يا 2 مرحله ای باشد .
واکنش زنجيره پليمراز خودش فرآيندی است که برای تقويت نمونه های DNA بکار می رود ، از طريق پليمراز DNA با واسطه ی حرارت .
PCR نسخه برداری معکوس نبايد با واکنش زنجيره پليمراز زمان واقعی که غالباَ به صورت RT-PCR خريد و فروش می شود ، اشتباه شود .