روشهاي کشت ميکروارگانيسمها
- کشت ميکروارگانيسمهاي هوازي
- کشت بي هوازي باکتريها
- کشت بي هوازي باکتريها با استفاده از ديسکاتور
- روش شمارش مستقيم
روش کشت پورپليت را براي شمارش ميکروارگانيسمها
در روش پورپليت با توجه به رقتهاي مختلف تهيه شده از نمونه غذايي براي هر رقت 2 تا 4 ظرف پتري اختصاص داده مي شود و يک ظرف نيز به عنوان کنترل براي اطمينان از سترون بودن روف پتري و محيط کشت در نظر گرفته مي شود. روي ظروف پتري را با شماره نمونه، رقت و تاريخ آزمايش مشخص کرده، در هر دو يا چهار ظرف پتري از رقت مربوط ، يک ميلي ليتر قرار مي دهند به اين ترتيب با استفاده از يک پيپت، کليه رقتها به ظروف پتري منتقل مي شوند، محيط کشت مناسب قبلاً ذوب و در حمام مادي 45 درجه سانتيگراد نگهداري مي شود پس از ريختن رقتهاي مختلف ماده غذايي به داخل ظروف پتري به هر ظرف حدود 15 ميلي ليتر از محيط کشت مذاب که حرارت آن بيشتر از 45 درجه نباشد اضافه مي شود . پس از آن بلافاصله در ظرف را بسته، آن را 15 بار از عقب به جلو، 5 بار در جهت عقربه هاي ساعت، 5 بار از چپ به راست و 5 بار خلاف عقربه هاي ساعت به آرامي حرکت مي دهند تا نمونه و محيط کشت بخوبي مخلوط شوند.
کمي صبر کنيد تا محيط کاملاً ببندد و بعد، از ميحط مذاب که همچنان در حمام بن ماري نگهداري شده مقدار کمي روي هر ظرف پتري مي ريزند به طوري که لايه نازکي از محيط سطح ظرف پتري را بپوشاند. در نتيجه اين عمل از آلوده شدن سطحي جلوگيري مي شود و همچنين تا اندازه اي شرايط بي هوازي براي نشان دادن حالات تخميري برخي از باکتريها ايجاد مي گردد. پس از بسته شدن لايه دوم ظروف پتري را به طور واژگون در گرمخانه با توجه به حرارت مناسب رشد باکتري مربوط قرار مي دهند. کشتها را مدت 24 ساعت در گرمخانه نگهداري مي کنند و پس از اين مدت به کمک دستگاه پرگنه شمار، پرگنه هاي ظاهر شده در ظروف پتري را که بين 300 – 30 پرگنه دارند مي شمارند. مجدداً 24 ساعت ديگر ظروف را در گرمخانه قرار داده، پس از اين مدت يک بار ديگر نيز تعداد پرگنه ها را مي شمارند. ميانگين تعداد پرگنه هاي شمارش شده در دو يا چهارظرف پتري با در نظر گرفتن رقت آن تعداد ميکروارگانيسمهاي موجود در ماده غذايي را تعيين مي کند.
روش کشت سطحي را براي شمارش ميکروارگانيسمها
در اين روش بايد ظروف پتري حاوي محيط کشت قبلاً تهيه شده باشند و سطح محيط با قراردادن آنها در گرمخاه 55 -50 درجه سلسيوس به مدت نيم تا دو ساعت خشم شود. در اين مدت بايد در ظرف پتري باز و سطح محيط رو به پائين باشد. سپس با توجه به رقتهاي تهيه شده، براي هر رقت 2 تا 4 ظرف پتري انتخاب نمود و يک ظرف به عنوان کنترل منفي در نظر گرفت . روي هر ظرف پتري را با شماره نمونه رقت و تاريخ کشت مشخص مي کنند و پس از تهيه رقتها، از رقيق ترين آنها به کمک پيپت 1/0 ميلي ليتري برداشت کرده، در سطح محيط مي ريزند و بعد همان پيپت را رقت بعدي که 10 برابر بيشتر است سه بار شسته و 1/0 از آن را برداشته در ظرف پتري مربوط مي ريزند. به همين ترتيب ادامه داده مي شود تا آخرين رقت، سپس براي هر رقت از يک پخش کننده شيشه اي سترون استفاده کرده، نمونه را بخوبي در سطح ظرف پتري مي گسترانند. نحوه حرکت ميله شيشه اي يا آنس پلاتين روي سطح محيط کشت بايد به گونه اي باشد که از زخمي کردن سطح محيط کشت جلوگيري کند. انجام اي کار با استفاده از ميله شيشه اي سترون آسانتر مي باشد.سپس ظروف پتري را مانند روش قبل با توجه به انتخاب درجه حرارت و زمان گرمخانه گذاري، مدت 24 ساعت در گرمخانه 1 35 درجه سلسيوس قرار داده، پس از 24 ساعت ظروفي را که بين 300- 30 پرگنه دارند مي شمارند. مجدداً ظروف را براي 24 ساعت ديگر گرمخانه گذاري کرده، پس از آن پرگنه ها را شمارش مي کنند و ميانگين شمارش را بدست مي آورند.
روش شمارش باکتريها با کاغذ صافي چه مزايايي دارد و بيشتر در چه مواردي به کار مي رود
کاغذهاي صافي مخصوص ميکروب شناسي در صنعت ساخته شده است که به دليل داشتن منافذ بسيار ريز، ميکروبها را در خود نگه مي دارند. از اين کاغذ صافيها براي ستون کردن مايعات و محلولهاي مختلف حساس به حرارت استفاده مي شود. بعضي از کارخانه هاي سازنده وسايل آزمايشگاهي از اين نوع کاغذها با قيفهاي مخصوص که در برابر حرارت مقاوم اند و قابل سترون شدن مي باشند براي شمارش و جستجوي باکتريها در آب و فرآورده هاي دارويي ساخته اند و حتي بعضي از سازندگان ظروف پتري مخصوص که قطر آنها متناسب با کاغذهاي صافي است و محيط هاي کشت آماده در آمپولهاي کوچک براي يکبار کشت و حتي گرمخانه هاي کوچک که با برق اتومبيل و يا با باتري کار مي کنند براي عمليات صحرايي تهيه و عرضه کرده اند. از اين صافيها براي جستجو و شمارش ميکروبها در آب آشاميدني و ديگر آشاميدنيهايي که تعداد باکتريهاي آنها کم است و لازم مي باشد که حجم زيادي از نمونه براي شمارش و جستجوي باکتري بکار رود استفاده مي شود.
از اين روش در بهداشت محيط و کنترل آب و فاضلاب و بررسيهاي همه گيري شناسي بسيار ارزشمند است.
روش شمارش مستقيم
در روش شمارش مستقيم مي توان از لامهاي مخصوص نئوبار و يا لام توما که معمولاً براي شمارش گلبولهاي خون بکار مي رود استفاده نمود. بدين ترتيب که نمونه مورد آزمايش به نسبتهاي معين با آب مقطر و يا سرم فيزيولوژي و يا هر رقيق کننده مناسب ديگر، رقيق مي شود. بعد از رقت تهيه شده روي لام توما ريخته، يک لامل سنگين روي آ ن قرار مي دهند. چند دقيقه صبر کرده، سپس در زير ميکروسکوپ با عدسي 40 ميکروارگانيسمها را در حجم معيني شمارش مي کنند و با توجه به رقت نمونه – تعداد ميکروارگانيسمها در هر گرم و يا سانتيمتر مکعب بدست مي آيد.